LONZA Amaxa 4D-Nucleofector細胞核轉染系統

在生命科學研究中，將DNA、RNA或蛋白質引入細胞，以改變其基因型或表型的過程被稱為轉染，在各類研究中十分重要。傳統的電穿孔是一種物理轉染方法，通過對細胞施加電脈沖，改變細胞膜的通透性，并通過電場將外源分子移動到細胞中。電穿孔技術是細胞系中轉染大型DN段的強大工具，但其高細胞毒性、轉染原代細胞和干細胞的低效率，限制了其廣泛應用。


LONZA 4D-Nucleofector（原Amaxa 4D-Nucleofector）細胞核轉染系統，創新性地結合經典電穿孔技術和細胞特異性電轉染液，實現了DNA、RNA、小分子物質高效轉染各類哺乳動物貼壁細胞和懸浮細胞。

LONZA 4D-Nucleofector技術不依賴于細胞有絲，不受細胞增殖的影響，可直接將外源基因導入細胞核中，即使是未的原代細胞（如靜止的T淋巴細胞或神經元），也可以快速表達。


圖. GFP標記的質粒轉染新生兒皮膚成纖維細胞，2小時后用3.5% PFA 固定，共聚焦顯微鏡可觀察到GFP蛋白在細胞核內表達。

LONZA Nucleofector對質粒DNA轉染效率高達90％，寡核苷酸（如siRNA）轉染效率高達99％，面世20年來，已成功轉染＞1200種細胞系、＞130種原代細胞，并在干細胞、免疫細胞、神經細胞等各類較難轉染的細胞中獲得了優秀的轉染效果。

4D-Nucleofector細胞核轉染特點
1.針對每種細胞優化的電脈沖參數，可將底物導入細胞質甚至是細胞核；
2.特殊配方的電轉染液，同時提供高轉染效率和細胞保護，提高細胞轉染后存活率；
3.全程實驗指導，從細胞來源、傳代、培養條件、培養基、到轉染后的培養技巧，已形成成熟的實驗方案。



4D-Nucleofector核轉染系統為基因治療研究、免疫治療研究、干細胞研究等提供了方便的工具。相比電穿孔在內的其他非病毒轉染技術，更具優勢：
-采用高分子聚合物電極，避免傳統鋁電極的離子毒害，維持細胞生理狀態，提高存活率。
-轉染后可快速觀察實驗結果，例如轉染GFP后zui快2小時可觀察到蛋白。
-無需自己優化條件，擁有超過650種細胞類型的現成程序，可直接使用，quan球共享數據庫，超過1500條轉染數據可供參考。
-可轉染包括DNA、mRNA、miRNA、siRNA、肽、蛋白質在內的多種底物。
-可用于難以轉染的原代細胞、干細胞、神經元、細胞系。
-可不用消化細胞，進行貼壁細胞的原位轉染。
-靈活的轉染規模縮放，可在低、中、高通量中輕松轉移，實現2×10^4至1×10^9個細胞數量的輕松擴展。
-已在quan球8000多家同行評議的出版物中發表。

最近，LONZA 4D-Nucleofector核轉染系統已廣泛應用于通過RNAi、CRISPR進行的基因編輯研究、以及iPS誘導多能干細胞、CAR-T的研究中，在包括功能和結構基因組學、藥物發現以及基因和細胞療法的研究中大放異彩。

LONZA 4D-Nucleofector細胞核轉染系統參數

4D-Nucleofector細胞核轉染系統采用模塊化設計，可根據研究者的需求，自行組合數個模塊形成一套完整系統。

常用模塊組合參考：
常規小規模轉染：C+X
貼壁細胞原位轉染：C+Y
懸浮+貼壁細胞轉染：C+X+Y
大規模轉染：C+X+LV
摸索復雜轉染條件：C+X+96孔



各模塊功能和應用：
1、C模塊：4D-Nucleofector系統的控制單元，內置轉染程序，將不同的功能單元（模塊）整合為一個系統，以運行不同的應用程序。



2、X模塊：用于懸浮細胞、或貼壁細胞消化后的小規模轉染，轉染細胞數量2×10^4至2×10^7。可同時轉染2個100μL電轉杯、1個16孔電轉板條（每孔20μL），每個電轉杯、每個孔可獨立設置程序。另外在使用96孔模塊時，也需要X模塊。



3、Y模塊：用于貼壁細胞不經消化的原位轉染，可同時轉染1個24孔電轉板條（每孔350μL），每個孔可獨立設置程序。



4、LV模塊：用于同一種懸浮細胞、或同一種貼壁細胞消化后的大規模轉染，轉染細胞數量1×10^7至1×10^9。可使用1mL手動進樣電轉盤、或20mL連續進樣電轉盤。通常使用X模塊小試摸條件，再用LV模塊線性放大轉染規模。



5、96孔模塊：用于同時轉染96個樣品的細胞，轉染細胞數量2×10^4至1×10^6。每個孔可獨立設置程序。必須與X模塊結合使用。



參考文獻：
1.Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing.Strecker J, et al. Nature (2019) 10(1): 212 

2.Gene correction for SCID-X1 in long-term hematopoietic stem cells.Pavel-Dinu M, et al. Nat Commun. (2019) 10 (1): 1634

3.Orthotopic replacement of T-cell receptor a- and ?-chains with preservation of near-physiological T-cell function.Schober K, et al. Nat Biomed Eng (2019) 10: 01 

4.Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells.Oh SA, et al. Curr Protoc Immunol (2019) 124(1): e69 

5.Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.Nguyen DN, et al. Nat Biotechnol (2019) 1: 1 

6.CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Hultquist JF, et al. Nat Protocols (2019) 14(1): 1-27 

7.Bacteria-free minicircle DNA system to generate integration-free CAR-T cells.Chen Cheng, et al. J Med Genetics (2019) 56: 10–17 

8.Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Shifrut E, et al. Cell (2018) 175(7): 1985-1971 

9.Guide Swap enables genome-scale pooled CRISPR-Cas9 screening in human primary cells. Ting PY, et al. Nat Methods (2018) 15(11)

10.Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity.Castiglia S,et al.J Transl Med (2018) 16: 237 

11.A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Vakulskas CA,et al.Nat Med (2018) 24(8): 1216-1224

12.Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.Roth TL,et al.Nature (2018) 559: 405-9

13.Nucleofection with Plasmid DNA for CRISPR/Cas9-Mediated Inactivation of Programmed Cell Death Protein 1 in CD133-Specific CAR T Cells.Hu B,et al.Hum Gene Ther (2018)

14.Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.Seki A,et al.J Exp Med (2018) 215(3): 985-997

15.Improved Expansion and In Vivo Function of Patient T Cells by a Serum-free Medium.Medvec AR,et al.Mol Ther Methods Clin Dev. (2017) 7; 8: 65-74

16.Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.Hudecek M1,et al.Clin Exp Immunol (2017) 52(4): 355(80) 

17.CRISPR-Mediated Integration of Large Gene Cassettes Using AAV Donor Vectors.Bak RO,et al.Cell Rep (2017) 20(3): 750-756 

18.CRISPR-Cas9 mediated LAG-3 disruption in CAR-T cells.Zhang Y,et al.Frontiers in Immunology (2017) 1: 1-9 

19.CRISPR/Cas9-mediated PD-1 disruption enhances anti-tumor efficacy of human chimeric antigen receptor T cells.Rupp LJ1,et al.Scientific Reports (2017) 7 (1): 737 

20.A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors.Park RJ, et al.Nat Genet (2017) 49(2): 193-203